Synteza i charakterystyka spektroskopowa fluorescencyjnych nanoklasterów srebra syntezowanych na oligonukleotydach zawierających strukturę G˗kwadrupleksu

Abstract

Wykorzystanie specyficznych sekwencji DNA jako rusztowań dla nanoklasterów (AgNCs) pozwala na modyfikowanie właściwości optycznych układów i wynika z różnego powinowactwa jonów srebra do zasad azotowych, spośród których zasady cytozynowe tworzą najtrwalsze kompleksy C˗Ag+˗C. Zaletą tak otrzymanych znaczników jest ich wysoka fotostabilność oraz możliwość łatwej integracji z domenami funkcjonalnymi, takimi jak aptamery czy DNAzymy. W ramach pracy doktorskiej opracowano serię dwufunkcyjnych sond DNA, w których domena bogata w cytozynę (C12), głównie służąca jako rusztowanie dla nanoklasterów srebra i odpowiedzialna za generowanie sygnału fluorescencyjnego, została połączona z oligonukleotydami zdolnymi do tworzenia G˗kwadrupleksów (G4) – o sekwencji telomerowej (Tel22) oraz sekwencji aptameru wiążącego trombinę (TBA). Przeprowadzone badania z wykorzystaniem spektroskopii UV-Vis, fluorescencji oraz dichroizmu kołowego (CD) wykazały, że synteza nanoklasterów srebra na dwufunkcyjnych fragmentach DNA nie zaburza zdolności domeny G-kwadrupleksowej do kompleksowania jonów K+. Istotnym elementem rozprawy była analiza wpływu architektury oligonukleotydu na sprawność analityczną sondy. W pierwszym etapie badań stwierdzono, że fluorescencyjne nanoklastery srebra syntezowane na dwufunkcyjnych oligonukleotydach zawierających strukturę G4 o sekwencji Tel22 wykazują wyższą czułość w stosunku do jonów K+ niż w przypadku sekwencji TBA. Wykazano, że zmiana lokalizacji domeny C12 (koniec 5’ względem 3’) pozwala na istotną poprawę parametrów emisyjnych oraz stabilności układu. Przesunięcie domeny C12 przed fragment Tel22 skutkuje otrzymaniem nanoklasterów srebra o silnej jednopasmowej fluorescencji w zakresie czerwonym (~620 nm). Kolejne modyfikacje matrycy C12Tel22 polegały na wprowadzeniu łącznika T5 między domeną C12 a G4 lub wprowadzeniu fluorescencyjnego analogu cytozyny, tC. W obu przypadkach otrzymano silnie świecące układy z tym, że obecność łącznika T5 spowodowała utworzenie nanoklasterów o emisji zielonej (~520 nm), a w drugim przypadku emisja tC (~510 nm) okazała się dominująca. Wprowadzenie miejsc inwersji polarności do fragmentu TBA dwufunkcyjnej matrycy oligonukleotydowej skutkowało otrzymaniem nanoklasterów srebra emitujących w zakresie czerwonym z czasem życia krótszym niż w przypadku niemodyfikowanych matryc TBA. Dodatkowo analiza DLS tych układów wykazała ich tendencję do tworzenia agregatów. Najwyższą efektywność w monitorowaniu zmian stężenia jonów potasu (K+) w obecności jonów Na+ wykazał układ C12Tel22˗AgNCs o emisji czerwonej, osiągając granicę wykrywalności na poziomie 0,68 mM zarówno dla matrycy niemodyfikowanej, jak i dla matrycy modyfikowanej pochodną cytozyny, tC. Opracowane układy C12Tel22-AgNCs i C126tCTel22-AgNCs wykazują liniowy zakres roboczy detekcji K⁺ od 1 do 10 mM w obecności 150 mM Na⁺, co w pełni pokrywa klinicznie istotny zakres stężeń jonów potasu wynoszący od 3,5 do 5,5 mM w płynach zewnątrzkomórkowych i osoczu krwi. Wyniki uzyskane w warunkach imitujących środowisko zewnątrzkomórkowe, poparte analizami mikroskopowymi (AFM, TEM) oraz badaniami komórkowymi, potwierdzają wysoki potencjał aplikacyjny opracowanych sond w badaniach przezbłonowego transportu jonów potasu.

The utilization of specific DNA sequences as scaffolds for silver nanoclusters (AgNCs) enables the modulation of the optical properties of these systems, and comes from the differential affinity of silver ions toward nucleobases, among which, cytosine bases form the most stable complexes C˗Ag+˗C. An advantage of such syntesized fluorophores relies on their high photostability and easy integration with functional domains, including aptamers and DNAzymes. As part of the doctoral dissertation, a series of bifunctional DNA probes was developed in which a cytosine-rich domain (C12), serving primarily as a template for silver nanoclusters and responsible for generating a fluorescent signal, was attached to oligonucleotides capable of forming G-quadruplexes (G4), specifically the telomeric sequence (Tel22) and the thrombin-binding aptamer sequence (TBA). Studies employing UV-Vis fluorescence and circular dichroism (CD) spectroscopy demonstrated that the synthesis of silver nanoclusters on these bifunctional DNA constructs does not alter the ability of the G-quadruplex domain to complex K+ ions. A key element of the thesis was the analysis of how oligonucleotide architecture influencesthe probe's analytical performance. In the first stage of the study, it was found that fluorescent silver nanoclusters synthesized on bifunctional oligonucleotides containing G4 Tel22 structure exhibited higher sensitivity to K+ ions than those based on the TBA sequence. It was demonstrated that changing the localization of the C12 domain (from the 3' to the 5' end) significantly improved emission properties and system stability. Placing the C12 domain upstream of the Tel22 fragment resulted in the formation of silver nanoclusters emitting strong single-band fluorescence in the red region (~620 nm). Other modifications of the C12Tel22 template involved introducing a T5 linker between the C12 and G4 domains or incorporating a fluorescent cytosine analogue, tC. Both approaches yielded highly luminescent systems; however, the T5 linker led to the formation of nanoclusters with green emission (~520 nm), whereas in the second case, tC emission (~510 nm) dominated. Introducing polarity-inversion sites into the TBA fragment of the bifunctional oligonucleotidetemplate resulted in silver nanoclusters that emitted in the red region and exhibited shorter fluorescence lifetimes compared to unmodified TBA templates. Additionally, DLS analysis revealed a tendency for these systems to form aggregates. The red-emitting C12Tel22-AgNCs system demonstrated the highest efficiency in monitoring changes in potassium ion (K+) concentration in the presence of Na+ ions, achieving LOD of 0.68 mM for both the unmodified matrix and the one modified with the cytosine derivative tC. The C12Tel22-AgNCs and C126tCTel22-AgNCs systems exhibit a linear working range for K+ detection from 1 to 10 mM in the presence of 150 mM Na+, fully covering clinically relevant physiological concentrations of potassium ions in extracellular fluids and blood plasma, which typically range from 3.5 to 5.5 mM. Results obtained under conditions mimicking the extracellular environment, supported by microscopic analyses (AFM, TEM) and cellular studies, confirmed the high application potential of the developed probes for investigating transmembrane potassium ion transport.